不同产地和变型天麻药材的质量及其硫磺熏蒸前后的变化

　　[摘要]：天麻作为硫磺熏蒸较为严重的品种之一，其药材质量问题受到人们高度关注。该文利用全国8个主产区和3种主要变型天麻样品，基于UPLC-Q-TOF-MS/MS探讨不同产地和变型天麻药材的质量及其硫磺熏蒸前后的变化。结果表明，硫磺熏蒸处理后，天麻药材中除了巴利森苷E含量升高外，天麻素、巴利森苷、巴利森苷B、巴利森苷C这4种成分含量均降低，并且产生了一种新的硫熏标志物p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite。相比于产地来说，不同变型的天麻药材质量差异更大，尤其以红天麻和乌天麻的质量差异最为明显。此外，吉林产地的红天麻与其他产地的天麻在天麻素和巴利森苷类成分含量上最低，这可能与其种植方式和气候环境等因素有关。综合来看，硫磺熏蒸前后天麻质量差异要比不同产地和变型对药材质量的影响更明显，这主要归因于产生了新的硫熏标志物。

　　[关键词]：硫磺熏蒸天麻产地变型质量评价

　　天麻又名赤箭、定风草、独摇芝[1]，为兰科多年生植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥块茎，药食两用，具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络的功效，被誉为“治风之神药”，可用于治疗小儿惊风、癫痫抽搐、头痛眩晕、风湿痹痛等症[2]。天麻的化学成分主要有酚类及其苷类、有机酸类、甾醇类和多糖类，其中酚类及其苷类是天麻的主要活性成分，如天麻素和对羟基苯甲醇[3-5]。20世纪70年代天麻由野生变栽培后，栽培天麻成为主要商品来源，其种植主产地主要分布在云南、四川、贵州、湖北、陕西、河南等地[6]。此外，根据天麻茎杆颜色又可分为红天麻、乌天麻和乌红天麻等不同变型[7]。

　　近年来，硫磺熏蒸加工方法在中药材的初加工和贮藏环节应用普遍，主要起到干燥、防腐、漂白、延长贮藏期的作用[8-9]。但是硫熏过量不仅会残留大量二氧化硫，还会严重影响药材质量[10-12]。硫熏天麻在全国各产区是普遍存在的，成为硫熏较为严重的品种之一[13]，其质量问题受到人们广泛关注。然而目前还没有一种成熟有效的可替代硫磺熏蒸的方法。目前已有大量关于硫磺熏蒸对天麻药材质量的研究[14-16]，然而结合不同产地和变型对天麻硫熏前后药材质量变化的研究却鲜有报道。本研究基于UPLC-Q-TOF-MS/MS和代谢组学对全国主产地和主要变型的天麻药材质量及其硫磺熏蒸前后变化进行探讨，为全国天麻药材质量评价和硫熏对药材质量影响提供参考。

　　1 材料和方法

　　1.1 样品

　　新鲜天麻样品分别采自云南昭通、贵州大方、湖北宜昌、四川广元、安徽大别山、陕西汉中、河南郑州和吉林抚松8个产地，包括乌天麻、红天麻和乌红杂交天麻3种变型，即有11份天麻样品，采集时间为2016年11月。经中国中医科学院中药资源中心郭兰萍研究员鉴定为兰科植物天麻G.elata的干燥块茎，凭证标本存放于中国中医科学院中药资源中心。具体样品信息见表1。

　　1.2 仪器和试剂

　　ACQUITY UPLCTM H-Class系统(美国Waters公司，包括四元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、EmpowerTM3色谱工作站)，Waters Xevo G2-S QTOF-MS质谱系统(美国Waters公司)，BSA224S型分析天平(德国Satorius公司)，Eppendorf 5810R离心机(德国Eppendorf公司)。

　　对照品天麻素(中国食品药品检定研究院，批号110807-201507)，巴利森苷A(成都普瑞法科技开发有限公司，批号15082302)，巴利森苷B(成都普瑞法科技开发有限公司，批号15082013)，巴利森苷C(成都普瑞法科技开发有限公司，批号15082012)，巴利森苷E(成都普瑞法科技开发有限公司，批号15081606)，芦丁(成都普瑞法科技开发有限公司，批号140225)。乙腈(色谱纯，德国Merck公司)，甲醇(色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司)，Milli-Q超纯水，其他试剂均为分析纯。

　　1.3 天麻硫磺熏蒸处理

　　天麻样品分为对照组和处理组，其中对照组为不经硫磺熏蒸的新鲜天麻，处理组为硫磺熏蒸处理的天麻。采用课题组前期的硫熏方法，硫磺用量与药材用量比例为1∶20[17]，以保证药材彻底熏透。处理组具体操作：取新鲜洗净的天麻样品，蒸制10~20min，经蒸透断面无白心后，取出晾干表面水分。仿照产地农民熏蒸过程，取新鲜天麻放置在自制塑料箱上层，箱体两侧各开一小口，将硫磺放置在瓷盘中，点燃后放置在塑料箱下层，盖上顶盖。硫磺熏蒸2h后取出，50℃烘干，打粉备用。经过硫熏处理后，所有产地和变型的11份天麻均得到一一对应的硫熏和未硫熏样品，即22批处理后的样品，每批样品均为5个单株重复。

　　1.4 样品溶液制备

　　1.4.1 对照品溶液制备

　　精密称取适量5种天麻对照品，加50%甲醇分别制成单个对照品储备液，再分别精密量取各对照品储备液适量，制成混合对照品溶液，置于4℃备用。

　　1.4.2 供试品溶液的制备

　　精密称取天麻药材粉末0.05g(过60目)，加入50%甲醇2mL(内含芦丁内标物质)，室温下超声提取(功率120W，频率40kHz)60min，放置室温，补足失重，样品提取液13000r·min-1离心10min后，取上清液过0.2μm微孔滤膜，供UPLC-Q-TOF-MS分析用。

　　1.5 液相和质谱条件

　　1.5.1 液相色谱条件[18-21]

　　ACQUITY UPLCR HSS T3(2.1mm×100mm，1.8μm，美国Waters公司);流动相为0.1%甲酸-水溶液(A)-0.1%甲酸-乙腈(B);梯度洗脱(0~4min，0%~0.5%B;4~6min，0.5%~2%B;6~7min，2%~8%B;7~12min，8%~12%B;12~18min，12%~20%B;18~24min，20%~40%B;24~25min，40%~45%B;25~31min，45%~70%B;31~33min，70%~98%B;33~35min，98%B);流速0.5mL·min-1;柱温40℃，进样体积1μL。

　　1.5.2 质谱条件

　　Waters Xevo G2-S QTOF-MS质谱采用电喷雾离子化源(ESI)，采用负离子检测模式;扫描范围m/z50~1500，扫描时间0.2s，毛细管电压2000V，锥孔电压40V，除溶剂气体氮气900L·h-1，除溶剂温度450℃，离子源温度100℃。

　　1.6 天麻药材5个指标成分的相对定量分析

　　课题组在前期的研究中，发现以芦丁作为内标物不仅响应较好，而且在其出峰位置处无干扰，成功实现了相对定量分析[17]。本研究以芦丁(20.8mg·L-1)作为内标物，提取各天麻样品中5个分析物的峰面积与芦丁峰面积的比值，计算得到5个指标成分的相对含量，用于天麻样品间的相互比较。

　　1.7 数据处理

　　本研究采用MassLynxTM软件(4.1，美国Waters公司)对天麻化学成分进行分析，根据保留时间、精确相对分子质量、对照品和同位素的丰度和分布对目标化合物进行结构鉴定。为了准确鉴定化合物，分子式的参数设定：C[0~80]，H[0~150]，O[0~60]，N[0~10]，S[0~2]，P[0~2]，质谱偏差设置为5×10-6。同时，使用内标物芦丁和天麻混合样品分别进行相对定量和质量控制(QC)。接下来寻找天麻药材中的硫熏特征性差异成分，将前面采集得到的数据再依次导入Progenesis QI软件(美国Waters公司)和EZinfo软件进行数据分析。

　　2 结果

        硫磺熏蒸对天麻药材质量的影响

　　根据分子离子峰响应强度判断，硫熏后天麻药材中的天麻素和巴利森苷成分明显降低，见图1。推测天麻药材中各成分的变化可能是在二氧化硫和水形成的酸性环境下，发生降解，亚磺酸化或氧化还原反应的结果。此外，从图1B可以发现，硫熏后的天麻样品中产生了新的成分。根据其质谱信息，结合其裂解碎片，发现该成分与课题组前期得到的天麻硫熏标志物p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite(p-HS)相一致[17-18]，其结构式见图1。

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